擴增子測序是對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序。16S/18S/ITS等擴增子測序即通過提取環境樣品的DNA,選擇合適的通用引物擴增16S/18S/ITS的某一或某幾個區,使用Illumina MiSeq/HiSeq將目的區域正反向讀通,通過檢測目的區域的序列變異和豐度,對環境樣本物種分類及豐度、種群結構、系統進化、群落比較等方面信息進行分析的研究方法。
宏基因組 ( Metagenome)(也稱微生物環境基因組Microbial Environmental Genome, 或元基因組)是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名詞, 其定義為“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即環境中全部微小生物遺傳物質的總和。它包含了可培養的和未可培養的微生物的基因,目前主要指環境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。宏基因組學(或元基因組學,metagenomics)是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段,以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。一般包括從環境樣品中提取基因組DNA, 進行高通量測序分析,或克隆DNA到合適的載體,導入宿主菌體,篩選目的轉化子等工作。
特定生物種基因組研究使人們的認識單元實現了從單一基因到基因集合的轉變,宏基因組研究將使人們擺脫物種界限,揭示更高更復雜層次上的生命運動規律。在目前的基因結構功能認識和基因操作技術背景下,細菌宏基因組成為研究和開發的主要對象。細菌宏基因組、細菌人工染色體文庫篩選和基因系統學分析使研究者能更有效地開發細菌基因資源,更深入地洞察細菌多樣性。
全基因組測序分為從頭測序(de novo sequencing)和重測序(re-sequencing)。
從頭測序(de novo)不需要任何參考基因組信息即可對某個物種的基因組進行測序,利用生物信息學分析方法進行拼接、組裝,獲得該物種的基因組序列圖譜,從而推進該物種的后續研究。
基因組重測序是對有參考基因組物種的不同個體進行的基因組測序,并在此基礎上對個體或群體進行差異性分析?;蚪M重測序主要用于輔助研究者發現單核苷酸多態性位點(SNPs)、拷貝數變異(CNV)、插入/缺失(Indel)等變異類型,以較低的價格將單個參考基因組信息擴增為生物群體的遺傳特征。全基因組重測序在人類疾病和動植物育種研究中廣泛應用。
微生物是地球上最豐富、最多樣的生命形式,它們是所有生態系統的重要組成部分,在醫療健康領域和工業應用領域中發揮著至關重要的作用。微生物基因組學研究在醫學上可應用于致病相關基因的鑒定、開發新型抗生素等,而在生物技術上可用于生物降解、酶工業、食品生物以及抗生物質的研究,同時對進化、功能預測等方面也有著重要意義。
自1994年美國發起微生物基因組研究計劃(MGP)以來,微生物組學在生物領域蓬勃發展,而在2001年中國繪制出首張微生物基因組“完成圖”以后,隨著高通量測序技術的誕生,微生物基因組研究也進入了井噴期,我國先后啟動了萬種微生物基因組計劃、百萬微生態系統基因組計劃等。
研究的深入依賴技術的進步。短讀長測序技術由于無法跨越富含重復區域的基因組使得很多微生物研究止步于基因組草圖,而長讀長測序技術卻可以輕松獲取細菌基因組完成圖,同時在復雜微生物群落的鑒定中可達到“種級別”的鑒定水平。Frank等人于2016年結合Hiseq2000和PacBio RS II對沼氣反應器內微生物宏基因組進行研究發現PacBio技術能顯著提升組裝水平,而2013年Chin等僅運用PacBio就組裝出16個微生物基因組,與參考基因組一致性達99.9999%。
如果說PacBio技術為微生物研究打開新世界的大門,那么基于納米孔電流檢測的ONT技術則開啟了微生物組學的黃金時代。
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Krona分析,通過可視化交互形式,直觀展示不同樣本或分組之間的物種多樣性的差異。
線性判別分析(Linear Determinant Analysis, LDA)是對費舍爾的線性鑒別方法的歸納,這種方法使用統計學、模式識別和機器學習方法,試圖找到兩類物體或事件的特征的一個線性組合,以能夠特征化或區分它們。所得的組合可用來作為一個線性分類器,或者更常見的是,為后續的分類做降維處理。
根據物種的相對豐度,選取門水平top5、屬水平top15、種水平top20的優勢物種,分析各樣本間優勢物種的分布情況。
選定一個或多個需要分析的樣品,選定一個分類學水平,按照相應多樣性信息作圖,反映各樣品的群落結構。